Nucleic acid probes and method for detecting ureaplasma urealyticum

ABSTRACT

A method of detecting a nucleic acid sequence in  Ureaplasma urealyticum  serovar 3 includes the steps of isolating a specimen containing nucleic acid; and analyzing the specimen with an assay such as in situ hybridization, Southern blotting, single strand conformational polymorphism, restriction endonuclease fingerprinting (REF), PCR amplification, 5′ nuclease assay (TaqMan PCR), and DNA-chip analysis using the nucleic acid sequences SEQ ID Nos:1-181.

RELATED APPLICATIONS

[0001] This application is a divisional of U.S. patent application Ser.No. 09/601,198 filed Dec. 8, 2000, which is the U.S. national phase ofPCT/US99/01972 filed Jan. 29, 1999, which claims priority of U.S.Provisional Application Ser. No. 60/073,189 filed Jan. 30, 1998.

GRANT REFERENCE

[0002] The subject invention was made with government support under agrant from the National Institutes of Health, Grant No. NIH-AI28279. Thegovernment has certain rights in the invention.

TECHNICAL FIELD

[0003] The present invention relates to the determination of thecomplete DNA sequence of Ureaplasma urealyticum (Uu) and to the use ofnovel genes and sequences as probes and primers for assays for use inthe detection and/or quantification of Uu in a sample.

BACKGROUND OF THE INVENTION

[0004]Ureaplasma urealyticun (Uu) is a Mycoplasma which was firstdiscovered in men with nongonococcal urethritis (NGU) in 1954.Approximately two-thirds of adults have Uu as part of their normalflora. Uu has been associated with and suspected as a pathogen inadverse pregnancy outcomes such as chorioamnionitis, intrauterineinfection, and premature births. Uu has also been diagnosed as thecausative agent of neonatal diseases such as pneumonia, meningitis, andsepsis. Uu has also been isolated in certain patients suffering fromsuppurative arthritis, especially those having hypogammaglobulinemia.

[0005] The primary mechanism of transmission of Uu is by sexual contactwhich can then be transmitted to neonates born to infected mothers.

[0006] The biology of Uu, which is a member of the Mycoplasma family, isunique. The Mycoplasma family is a family of wall-less bacteria whichhas descended from low G+C Gram positive bacteria. The Mycoplasma areincluded among the smallest free-living cells known. Additionally, theMycoplasma use an alternate genetic code wherein the codonUGA=tryptophan (trp) rather than a stop or termination codon.Additionally, the Mycoplasma are biochemically different in that theypossess no TCA cycle and most Mycoplasma require cholesterol for growth.

[0007]Ureaplasma urealyticum infections are commonly asymptomatic, it isimportant to have specific and sensitive methods for detecting theirpresence in a patient. Mycoplasmas including Ureaplasma urealyticum aresomewhat atypical organisms and are difficult and are complex toculture. It is difficult for clinical laboratories to perform cultureisolation of Mycoplasmas and consequently there are no relatively easyand inexpensive methods for diagnosing the presence of this bacterium.

[0008] Genetic probes and detection methods for detecting Mycoplasmasincluding Ureaplasma urealyticum have been developed. U.S. Pat. No.5,843,667 to Weisburg et al. discloses various nucleic acid sequenceswhich are capable of hybridizing to rRNA and rDNA of Mycoplasmaetiological agents including Ureaplasma urealyticum. The nucleic acidprobes disclosed in the Weisburg et al. patent specifically hybridize to16S rRNA or 16S rDNA of Ureaplasma urealyticum. Similarly, U.S. Pat. No.5,728,522 to Del Vecchio et al. discloses a method for detectingUreaplasma urealyticum involving in vitro nucleic acid amplification bycontacting Ureaplasma urealyticum target nucleic acids with anoligonucleotide fragment consisting of a contiguous nucleotide ofUreaplasma urealyticum DNA inserted into the plasmid pCU3900 having ATCCAccession No. 97424.

[0009] Neither U.S. Pat. Nos. 5,843,667 nor 5,728,522 disclose theentire DNA sequence of Ureaplasma urealyticum serovar 3 and, in fact,only disclose small DNA and/or RNA sequences from Ureaplasmaurealyticum.

[0010] Therefore, in order to better understand the nature and effectsof Ureaplasmna urealyticum, as well as to more accurately andconsistently detect and diagnose the presence of Ureaplasma urealyticumin a potential carrier and to better develop antibiotic drugsspecifically effective against Ureaplasma urealyticum, which,consequently, has no current antibiotic directed specifically againstit, it would be advantageous to isolate and determine the gene sequencesand functions which are unique to Ureaplasma urealyticum and utilizethese sequences as a basis for detecting Ureaplasma urealyticum in apatient and thereby be able to more effectively treat those patientsinfected with Ureaplasma urealyticum as well as to develop new andimproved drug therapies against Ureaplasma urealyticum.

SUMMARY OF THE INVENTION

[0011] A method of detecting a nucleic acid sequence in Ureaplasmaurealyticum serovar 3 includes the steps of isolating a specimencontaining nucleic acid; and analyzing the specimen with an assay suchas in situ hybridization, Southern blotting, single strandconformational polymorphism, restriction endonuclease fingerprinting(REF), PCR amplification, 5′ nuclease assay (TaqMan PCR), and DNA-chipanalysis using the unique nucleic acid sequence SEQ ID Nos:1-181.

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0012] The present invention provides the sequence of the genome of thebacterium Ureaplasma urealyticum serovar 3 (Uu). Uu is an opportunisticpathogen of the human urogenital tract that is a significant cause ofadverse pregnancy outcome, neonatal disease, and suppurative arthritis.Uu contains a single circular chromosome having 751,719 base pairsdesignated SEQ ID No:182. Of these base pairs, only 25.5% of the basesare G or C. The Uu chromosome codes for approximately 600 genes. Asdiscussed above, Ureaplasmas use an unusual genetic code in which TGAcodes for tryptophan instead of for translation termination. Although 62codons for amino acid are represented in the Uu genome, only 30 tRNAsare coded for by the Uu genome. There are only two rRNA operons.

[0013] The present invention also consists of purified, isolated, andcloned nucleic acid sequences encoding novel genes designated SEQ IDNos:1-181. The nucleic acid can be genomic DNA, cDNA, or mRNA.

[0014] The invention further provides purified protein sequences asencoded by the novel Uu genes and analogs and mutations thereof.

[0015] The present invention further includes the recombinant proteinsencoded by the genes. These recombinant proteins are isolated andpurified by techniques known to those skilled in the art.

[0016] As used herein, the term “analog” is used to define a compound ormolecule which will be generally at least 70% homologous over anyportion that is functionally relevant. In more preferred embodiments,the homology will be at least 80% and can approach 95% homology to thenative protein. The amino acid sequence of any analog may differ fromthat of the native protein when at least one residue is deleted,inserted, or substituted but the protein remains functional. Differencesin glycosylation can provide analogs.

[0017] As defined herein, the term “nucleotide” is used to define asubunit of nucleic acid consisting of a phosphate group, a 5′ carbonsugar, and a nitrogen containing base. In DNA, the 5′ carbon sugar is a2-deoxyribose. For RNA, the 5′ carbon sugar is a ribose.

[0018] As used herein, the term “oligonucleotide” is defined as anucleotide polymer (at least two nucleotides linked by a phosphodiesterbond).

[0019] As defined herein, the terms “nucleic acid probe” and “primer”are used to define a single stranded nucleic acid sequence that willcombine with a complementary single stranded target nucleic acidsequence to form a double-stranded molecule or hybrid. In the case ofthe primer, the hybrid can be used to initiate replication such as withPCR.

[0020] As used herein, the term “hybrid” is used to define the complexformed between two single stranded nucleic acid sequences by standardbase pairing.

[0021] As used herein, the term “hybridization” defines the process bywhich two complementary strands of nucleic acids combine to form adouble stranded molecule or hybrid.

[0022] As used herein, the term “stringency” is used to define thetemperature and solvent composition existing during hybridization andthe subsequent processing steps at which a hybrid comprised of twocomplementary nucleic acid sequences will form. Stringency also definesthe amount of homology, the conditions necessary, and the stability ofhybrids formed between target sequences and nontarget sequences.

[0023] The present invention also provides vectors comprising anexpression control sequence operatively linked to the nucleic acidsequences of the Uu genes and portions thereof as well as mutantsequences. The present invention further provides host cells, selectedfrom suitable eukaryotic and prokaryotic cells, which are transformedwith these vectors.

[0024] Using the present invention, it is possible to transform hostcells including E. coli, using the appropriate vectors so that theycarry recombinant DNA sequences derived from Uu genes. Such transformedcells allow the study of the function and regulation of the particulargenes. Use of recombinantly transformed host cells allows for the studyof the mechanisms of Uu gene function and, in particular, it will allowfor the study of gene function and can be used in the development ofantibiotics or other drug therapies useful against Uu.

[0025] Vectors are known or can be constructed by those skilled in theart and should contain all expression elements necessary to achieve thedesired transcription of the sequences. Other beneficial characteristicscan also be contained within the vector such as mechanisms for recoveryof the nucleic acids in a different form. Phagemids are a specificexample of such beneficial vectors because they can be used either asplasmids or bacteriophage vectors. Examples of other vectors includeviruses such as bacteriophages, baculoviruses and retroviruses, DNAviruses, cosmids, plasmids and other recombination vectors. The vectorscan also contain elements for use in either prokaryotic or eukaryotichost systems. One of ordinary skill in the art will know which hostsystems are compatible with a particular vector.

[0026] The vectors can be introduced into cells or tissues by any one ofa variety of known methods within the art. Such methods can be foundgenerally described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992). Also, nucleicacids can be introduced by, for example, stable or transienttransfection, lipofection, electroporation and infection withrecombinant viral vectors. Introduction of nucleic acids by infectionoffers several advantages over the other listed methods. Higherefficiency can be obtained due to their infectious nature. See also U.S.Pat. Nos. 5,487,992 and 5,464,764. Moreover, viruses are veryspecialized and typically infect and propagate in specific cell types.Thus, their natural specificity can be used to target the vectors to aspecific cell type in vivo or within a tissue or mixed culture of cells.Viral vectors can also be modified with specific receptors or ligands toalter target specificity through receptor mediated events.

[0027] Recombinant methods known in the art can also be used to achievethe sense, anti-sense or triplex inhibition of target nucleic acid. Forexample, vectors containing anti-sense nucleic acids can be employed toexpress protein or anti-sense messages to reduce the expression of thetarget nucleic acid and therefore its activity.

[0028] According to the present invention, there is also provided amethod for diagnosing and detecting Uu in a subject. Carrier detectionis especially important in diagnosing and treating those individuals orpatients which may be infected with Uu. Identifying those infected bythe presence of Uu specific nucleic acid sequences can lead to earlierdiagnosis and treatment.

[0029] The methods for diagnosing and detecting Uu in a subjectgenerally comprise the steps of obtaining a sample from a test subject,isolating the appropriate test material from the sample and assaying thesample for the target nucleic acid sequences or gene products. Thesample can be tissue or bodily fluids from which genetic material and/orproteins are isolated using methods standard in the art. For example,DNA can be isolated from fluid or cells obtained from a vaginal swab.

[0030] More specifically, the method of Uu detection is carried out byfirst obtaining a sample of either cells or bodily fluid from a subject.Convenient methods for obtaining a cellular sample can include swabbingor fluid collection. Crude DNA samples can be isolated from the cells(or alternatively proteins isolated) by techniques well known to thoseskilled in the art. This isolated target DNA is then used for PCRanalysis (or alternatively, Western blot analysis for proteins) withappropriate primers derived from selected Uu gene sequences such as SEQID Nos:1-173 by techniques well known in the art. The PCR product wouldthen be tested for the presence of Uu specific sequences or variationsthereof in order to diagnose and detect Uu in the subject.

[0031] The specimen can be assayed for polypeptides/proteins byimmunohistochemical and immunocytochemical staining, ELISA, RIA,immunoblots, Western blotting, immunoprecipitation, functional assaysand protein truncation tests. In preferred embodiments, Westernblotting, functional assays, and protein truncation tests will be used.mRNA complementary to the target nucleic acid sequences can be assayedby in situ hybridization, Northern blotting and reversetranscriptase-polymerase chain reaction. Nucleic acid sequences can beidentified by in situ hybridization, Southern blotting, single strandconformational polymorphism, PCR amplification and DNA-chip analysisusing specific primers.

[0032] ELISA assays are well known to those skilled in the art. Bothpolyclonal and monoclonal antibodies can be used in the assays. Whereappropriate, other immunoassays, such as radioimmunoassays (RIA) can beused as are known to those in the art. Available immunoassays areextensively described in the patent and scientific literature. See, forexample, U.S. Pat. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578;3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533;3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771; and 5,281,521 aswell as Sambrook et al., 1992. The Uu gene sequences SEQ ID Nos:1-173can be expressed using protein expression technology such as generallydescribed in Sambrook et al., 1992. Those Uu proteins expressed usingrecombinant DNA technology can be used in ELISA or Western blot assaysfor serological based detection of Uu in patient samples. Theaforementioned Uu proteins can also be used to generate monoclonalantibodies that could be used in the detection of Uu.

[0033] In order to use the method of the present invention fordiagnostic applications, it is advantageous to include a mechanism foridentifying the presence or absence of target polynucleotide sequences(or alternatively proteins). In many hybridization based diagnostic orexperimental procedures, a label or tag is used to detect or visualizefor the presence or absence of a particular polynucleotide sequence.Typically, oligomer probes are labeled with radioisotopes such as ³²p or³⁵S (Sambrook, 1992) which can be detected by methods well known in theart such as autoradiography. Oligomer probes can also be labeled withnon-radioactive methods such as chemiluminescent materials which can bedetected by autoradiography (Sambrook, 1992). Also, enzyme-substratebased labeling and detection methods can be used. Labeling can beaccomplished by mechanisms well known in the art such as end labeling(Sambrook, 1992), chemical labeling, or by hybridization with anotherlabeled oligonucleotide. These methods of labeling and detection areprovided merely as examples and are not meant to provide a complete andexhaustive list of all of the methods known in the art.

[0034] The introduction of a label for detection purposes can beaccomplished by attaching the label to the probe prior to hybridization.

[0035] An alternative method for practicing the method of the presentinvention includes the step of binding the target DNA to a solid supportprior to the application of the probe. The solid support can be anymaterial capable of binding the target DNA, such as beads or amembranous material such as nitrocellulose or nylon. After the targetDNA is bound to the solid support, the probe oligomers are applied.

[0036] The present invention also provides a kit for diagnosis anddetection of Uu in a subject. The kit can include a molecular probecomplementary to specific genetic sequences found only in Uu andsuitable labels for detecting hybridization of the molecular probe andthe specific Uu gene thereby indicating the presence of Uu. Themolecular probe has a DNA sequence complementary to the targeted Uusequence. Alternatively, the kit can contain reagents and antibodies fordetection of specific Uu proteins. The above discussion provides thefactual basis for the use and identification of Uu, Uu genes, and Uugene products and the identification and detection of those infectedwith Uu.

MATERIALS AND METHODS

[0037] General Methods in Molecular Biology:

[0038] Standard molecular biology techniques known in the art and notspecifically described were generally followed as in Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory,New York (1992).

[0039]Ureaplasma urealyticum serovar 3 reference strain was obtainedfrom E. A. Freundt (Institute of Medical Microbiology, University ofAarhus, Aarhus, Denmark). Uu was grown in 10B medium until the media pHbecame alkaline, the cells were concentrated in a phosphate bufferedsaline solution by a combination of filtration and high speedcentrifugation. Uu genomic DNA was extracted from the cell suspensionusing an Invitrogen EZ DNA kit according to the manufacturer'sinstructions for isolating DNA from Gram positive bacteria.

[0040] The Uu genomic sequence was obtained by a process developed forthis project that is referred to as CROSS (Complete Random+OrderedShotgun Sequencing). In preparation for the complete random phase of thesequence analysis three different clonal libraries were prepared. Tomake a large insert library in lambda bacteriophage, Uu DNA waspartially digested using the restriction enzyme Sau 3A and fragmentscontaining between 7,000 and 11,000 base pairs were ligated into aNovagen Bluestar lambda vector according to the Novagen Lambda BluestarVector System instructions. Individual phage clones grown in E. coliwere collected in to a TM solution to stabilize the phage. The insertscontained in more than 1,500 individual Uu-lambda bacteriophage cloneswere amplified using XL-PCR according to the manufacturer's instructions(Perkin Elmer XL-PCR kit) using universal T3 and T7 primers. The ends ofthe XL-PCR amplicons were sequenced by performing reactions in a AppliedBiosystems 877 Catalyst Robotic Workstation and analyzing the reactantsusing either an Applied Biosystems 373 or 377 Prism DNA Sequencingapparatus. Two small insert libraries containing Uu DNA inserts weremade by ligating Uu fragments sheared to between 1,000 and 2,000 basepairs using nebulization or digested using either Rsa I, Alu I or San 3AI to between 1,000 and 2,000 base pairs. Inserts were ligated into thecloning vector pUC18. The plasmids were then ligated into E. coli.Sequencing templates were generated from bacteria containing Uu insertsin plasmids by the method of colony PCR. The ends of those DNA templateswere then sequenced using M13-40 forward and reverse primers byperforming reactions in a Applied Biosystems 877 Catalyst RoboticWorkstation and analyzing the reactants using either an AppliedBiosystems 373 or 377 Prism DNA Sequencing apparatus. After obtainingapproximately 2,400 DNA sequencing reads from the large insert lambdabacteriophage library and 7,600 DNA sequencing reads from the smallinsert plasmid libraries, the data were assembled using the DNA sequenceassembly software Autoassembler 1.4 (PE-Applied Biosystems). Gapsremaining in the genomic sequence were filled by an ordered phase whichwas a mix of “genomic walking” and “ordered shotgun sequencing”. Thosegaps in the sequence that were small were closed by either making a PCRamplicon that crossed the gap to use as a DNA sequencing template, orwere closed by sequencing using whole genomic DNA as a template (thelast method was developed as part of the Uu genome sequencing project,and is described in Heiner C. R., K. L. Hunkapiller, S. Chen, J. I.Glass, and E. Y. Chen. Sequencing multimegabase-template DNA withBigDye™ terminator chemistry PCR Methods & Applications. 8(5):557-6(1998). Large gaps or areas containing many small gaps were completedusing a method developed for “ordered shotgun sequencing” (Chen, E. Y.,Schlessinger, D. and Kere, J. Ordered shotgun sequencing, a strategy forintegrated mapping and sequencing of YAC clones. Genomics 17, 651-656(1993);Chen, C., Su, Y., Baybayan, P., Siruno, A., Nagaraja, R.,Mezzarella, R., Schlessinger, D, and Chen, E. Y. Ordered ShotgunSequencing of a 135 kb Xq25 YAC containing ANT-2 and four possiblegenes, including three confirmed by EST matches. Nucleic Acids Res. 24,4034-4041 (1996).) Briefly, a XL-PCR amplified insert from a large Uuinsert bacteriophage clone that spanned the gap or region of lowsequence quality was sonicated to generate Uu genome fragments between1,000 and 2,000 base pairs in length. Using colony PCR sequencing asdescribed earlier in this paragraph, 48 clones containing Uu insertswere sequenced and the new data was added to the assembly. All theassembled sequences were edited to remove low quality data and correctincorrect base calls made by the Applied Biosystems 373 and 377 PrismDNA sequencing software. Each of the 751,719 bases in the final assemblywas sequenced by at least two different high quality sequencingreactions.

[0041] Data checking and functional annotation of the Uu sequence waspreformed using a system based upon compiling the results from Genemarksearches (Borodovsky, M., McIninch, J., Koonin, E., Rudd, K., Medigue,C. and A. Danchin. 1995. Detection of New Genes in the Bacterial GenomeUsing Markov Models for Three Gene Classes. Nucleic Acids Research, 23,3554-3562.) for potential protein-coding genes, followed by BLASTsequence homology searches (Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D. J. (1997) “GappedBLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database searchprograms.” Nucleic Acids Res. 25:3389-3402) to determine matches toexisting genes and identify genes unique to Uu. This information wasthen loaded into a Microsoft SQL Server database that we have developedthat contains all Uu sequence and annotation information. The front-endfor this database is a web page that directly accesses the SQL Serverdata, and allows users to develop individualized queries that can beconstructed by setting desired options on a web form. This system is notonly used to query the similarity and alignment data, but is also usedin the direct annotation of the sequence. Web forms have been developedthat allow us to directly enter coordinate data along with geneidentification and similarity data into our annotation database.

[0042] The unique genes isolated, purified, and cloned which werederived from Ureaplasma urealyticum serovar 3. These sequences,designated SEQ ID Nos:1-173, can be specifically utilized as probes orprimers in the detection and diagnosis of Uu infection in a subject bythe methods described above. SEQ ID Nos:174-181 designate genesassociated with the urease complex of Ureaplasma urealyticum. In termsof developing or designing an antibiotic specifically targeted atUreaplasma urealyticum, the most logical genetic target or gene producttarget would be some component associated with the urease gene complex.

[0043] Throughout this application, various publications and patents arereferenced by citation or number. Full citations for the publicationsreferenced are listed below. The disclosures of these publications intheir entireties are hereby incorporated by reference into thisapplication in order to more fully describe the state of the art towhich this invention pertains.

[0044] The invention has been described in an illustrative manner, andit is to be understood that the terminology which has been used isintended to be in the nature of words of description rather than oflimitation.

[0045] Obviously, many modifications and variations of the presentinvention are possible in light of the above teachings. It is,therefore, to be understood that within the scope of the appendedclaims, the invention may be practiced otherwise than as specificallydescribed.

1 181 1 561 DNA Ureaplasma urealyticum 1 atgttaaata ttttaaataatgtatctaat tcttcactat attcagccgc ttcaaatgct 60 actgcgcaaa ctggttcaaatttgatcaat gatctagttc cagaaacatt aaccgcttca 120 ggaattagta tcgctatttctgtttttagt gttataggta cgatcgttat tgctttgagt 180 gtattgccac aaacaattaaaactttacgt gaaaaagata cagcttcatt aagtttatta 240 ctattcttgc ttaatggtattgctacagcc tttttaactc tatacggtat tggacttgtt 300 acagttcatc caaattcattttcattctta gtggatatta aaaacggaat gttcatttat 360 aatagagaag agtgagttgctggatactta atctgcggta tcttcttaat tatgggtgaa 420 gcattatgtt cagtaacttcatttattgtt ctattctgca aagttaataa catgattaaa 480 gctaaaaaaa tgggaatgagcgaagaagaa tattatgaaa aacaaattaa accattccta 540 aaagtgaaag gagctaacta a561 2 477 DNA Ureaplasma urealyticum 2 atgaatttca cttcattatt gcaagatggtatatatgaag ttggtaatgg tgcaatcgtt 60 actgaccaat caccatattt aggaattacacctgattatc agggtgcata tggtttccca 120 acacaccctt gaggtatttt ctttcaagttgttggagcta ttttagtttt tggtgcttat 180 ttacctgctg ttattaaagt actaatttcaaaaagaactg aaaatttggc tattggtatg 240 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urealyticum 173ctacacatac tcattaaaag atattaaata tttataaatt tgtttttgtt gatattgaat 60tttttgtctt atattaaatg tataataagc taatctaaaa aaaataaaag gaagattttt 120gatcggtttt ttcggtgggt atttattgat ttttaaaatt aaatatcttg ctgtgctatt 180atgacaattg atccataaaa gataaattat tgtaataaat aacattaaaa aactaataca 240tgttaaaatt gtaaaatcta aatatttttt ataatttaat aatttttcat tatatccata 300atttaaagct aaaattaaat ttgtgataaa agaaattaat caaccagcta aaaatatact 360aataaaaact ccaataaatt tatatttaaa atataattta cctatcaaat aatcttttaa 420ttcttctaaa actattttca a 441 174 513 DNA Ureaplasma urealyticum 174ttatttttct tcttcaactt tcatttgctt taaatattta cgaatggcat attcaacttg 60caaattatta gtagcatttt caaagaaatc atggatggta cgaacatcat caaaatcttt 120aataccatca tcaacaaatc attttacaaa actaaatgtt tcaaaatcat tttcttccaa 180acatactttt gccatattgg ctacatgctt acgaactttt aattctgtat ctaaaatgtg 240ttttattaat tccttaggat tcgctggctt aaaattaaca tctacactaa atttagtgtg 300taatggaatt tcaactttac gagcatattc agaaattaaa ttcttgtgaa cacctaattt 360atcattgctt aaatcagcaa 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ccatctaatg caacaggaactatttctggt tctagtcagt gaacgtgagt 1380 atctaaacca ccagctgtat aaattttaccctcaccagct gaaatttcag ttgagatacc 1440 cacaatcata tcaacattat ctgttaaatgtggatttcca gatttaccaa tcgcagcaat 1500 ttttccattt ttaataccaa tatctgctttataaatacct gtataatcaa caattagtgc 1560 atttgtaata actaaatcca ttacttcagcattacctaat ttatcatcta acttcatagt 1620 agaattcatt cccatacctt cacgtagggtttttccacca ccaaaaacag attcttcacc 1680 ataagtagtt aagtcttttt caactttaactcaaagattt gtatctccta atctaacgct 1740 atcaccagtt gtaataccgt ataaatctgaataatttttt cttgaaattt taaacat 1797 180 375 DNA Ureaplasma urealyticum180 ttatttttta agttttccat taactaagcc atttacacct caaacttcgc gtgttccggc 60taaatcaata attgaaactt cttttttatc tcctggttca aaacgaatag cagtacctga 120tggaatatcg aaacgtcgtc cataagcaac tttgcgttct ttatcttcat ttcctttttc 180atcaaaaaat actaatgcac tattcacttc aaacaagtga aaatgtgatc caacttgtat 240aggacggtcc ccagtatttt taatactaat tacttttgcc tctctacctt cattcatcac 300aatttcacca ctagcgaaat taattgcccc tggtactaat ttacctggac taaattgact 360tgatgatcct gacat 375 181 306 DNA Ureaplasma urealyticum 181 ttatttgtaaattggatcgt gtacagaaac tagtttagta ccatcaggga aagtaacttc 60 aacttgaattatactaacca ttgtatctac accttccata acttgatcaa cacgtagtac 120 ttcacgagcagattgcatta ggtcagcaac tagcttacca tctcttgccc cttccattac 180 atgatcagtaattaaagcaa cagcttctga atagtttaat tttaaacctc tagctaaacg 240 tcttcttgcaacgtcagcag caactgttat caataatttt tggacttctc ttaatgatag 300 attcat 306

1. A polypeptide product and biologically active variants thereof of theexpression in a prokaryotic or eukaryotic host cell of a nucleotidesequence selected from the group consisting of SEQ ID No:60.